雷晓光课题组与合作者在利用酶催化方法实现药物分子高效合成领域取得重要进展

近日，77779193永利集团，北大-清华生命科学联合中心雷晓光课题组与中科院微生物研究所/天津工业生物技术研究所高书山课题组、以及中科院天津工业生物技术研究所孙周通课题组合作，以“Tuning an imine reductase for the asymmetric synthesis of azacycloalkylamines by concise structure-guided engineering”为题在Angew. Chem. Int. Ed. 上报道了针对亚胺还原酶（IREDs）的蛋白工程改造和利用该催化酶实现多个药物分子以及中间体的高效合成。该研究工作为IRED的理性设计和为酶催化技术在工业合成中的应用提供了新的研究策略。

手性胺在药物、农用化学品和材料中有着广泛的应用，近40%的药物含有一个或多个手性胺结构，因此胺的不对称合成在工业生产中极为重要。还原胺化是合成胺的一类重要的反应，它是在还原剂存在下利用前手性酮或醛与胺直接合成烷基化手性胺的一种方法。传统的不对称还原胺化反应不仅需要使用昂贵的过渡金属和手性配体，还存在着其他竞争性的副反应，例如过烷基化以及醛酮还原成醇，这限制了其在工业化生产过程中的应用。

考虑到酶催化具有低成本、高选择性、高催化效率、绿色无污染和可进化性等方面的明显优势，发现和改造可以催化还原胺化反应的亚胺还原酶（IREDs）一直是学术界和工业界的研究热点之一。然而，天然的IREDs 因催化效率低和稳定性差等问题阻碍了其在工业中应用。传统上，我们可以通过随机突变和高通量筛选的方式来提高IREDs的催化性质，然而这种方式耗时耗力，带来的成功充满偶然性，无法总结出可推广到其他IREDs理性改造之中的经验和规律。因此，找到一种快速高效改造IREDs的通用策略对于解决IREDs在工业生产中所面临的问题至关重要。

研究人员以N-Boc-3-哌啶酮和苄胺为模式底物，对IRED酶库进行筛选，仅获得了催化效率非常低（Kcat/Km = 0.001 min-1 mM-1），且立体选择性（78%, R）很差野生型蛋白IR-G36。为了对目标酶进行理性设计来提高酶的催化效率，作者首先解析了IR-G36的蛋白质结构。基于对IR-G36结构和多重序列保守性分析，作者利用辅因子氢键网络重构策略，显著提高了催化效率（Kcat/Km = 0.010 min-1 mM-1）和立体选择性（>99%, R）。随后，作者通过活性口袋氨基酸的单点饱和突变获得了18个优势突变，并利用三轮迭代组合突变策略对优势突变进行组合，获得了最优突变体M4。相对于野生型而言，M4的催化效率提高了3349倍（Kcat/Km = 3.350 min-1mM-1），同时大幅提高了底物载量并降低了酶的载量。此外，作者还通过理性设计对酶进行了热稳定性改造，结合蛋白内部氢键网络的重构和“consensus”策略，实现了热稳定性的显著提高（Tm值提高16.2 ℃）。最后，作者结合蛋白结构分析、分子对接和分子动力学模拟，解析了最终突变体催化效率、立体选择性和热稳定性提高的关键因素。

为了扩展亚胺还原酶的应用范围，研究人员利用突变体M5完成了不同氮杂环酮与多个胺供体的制备级反应，并且展现出优异的催化效率和立体选择性。同时，作者利用M5的实现了模式底物的百克级生物转化，在24.9 g/L底物浓度下，转化率达到97%，时空产率高达35.3 g L-1 d-1。

综上所述，相比于传统的随机突变策略，该研究所利用的催化机制导向的蛋白改造策略可以快速找到影响酶学性质的位点，从而大大降低蛋白工程化改造中所需的人力和时间成本。同时，这种研究策略对于其他IREDs的工程化改造也有极大的借鉴意义。因此，本项工作将进一步促进还原胺化酶在工业化生产中的开发和应用。

雷晓光教授，高书山研究员和孙周通研究员为共同通讯作者。高书山课题组张军博士，永利集团分子工程苏南研究院雷晓光教授团队特聘研究员廖道红博士，苏州青云瑞晶公司陈荣昌博士为共同第一作者。该工作得到中科院战略性先导科技专项，国家自然科学基金，国家科技部重点研究发展计划，中科院创新交叉团队项目，北京市卓越青年科学家计划，北京分子科学国家研究中心，北大-清华生命科学联合中心等多个国家重大科研项目和研究机构的资助。

论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/anie.202201908