二氮丙啶是一种独特的三元环官能团，光照后开环产生高活性中间体，在光化学领域有着广泛的应用。然而，其光反应机理长期以来被认为主要经过卡宾中间体，与蛋白质残基发生无差别插入，而对其具体细节，尤其是其他潜在中间体的存在及其对蛋白质残基的相互作用选择性，仍知之甚少。深入理解这些细节对于将二氮丙啶更精准地应用于蛋白质结构和动态研究至关重要。

　　77779193永利集团唐淳教授团队近日在《自然·通讯》发表题为《Dissecting diazirine photo-reaction mechanism for protein residue-specific cross-linking and distance mapping》(Nat Commun15, 6060 (2024)) 文章，突破了以往对二氮丙啶光反应机理的传统认知，揭示了更为精细的反应过程，并实现了蛋白质残基光交联位点的精准识别。这项研究将二氮丙啶应用于蛋白质结构的光交联质谱分析，使其精确度达到了与传统化学交联方法相媲美的水平。

　　图1: 二氮丙啶光解中间体及其对蛋白质残基的偏好示意图。

　　起点：克服既有方法的局限

　　烷基二氮丙啶的光交联（PXL）可提供较短的距离约束，是蛋白质结构研究的有力工具。然而，交联残基位点识别的模糊性是其短板，因此有很大的提升空间。为研究清楚其中机理细节，唐淳研究团队搭建了一套全新的设备，能够系统性地调节光强和照射时间，以定量分析二氮丙啶光解和光反应机理。

　　图2: 实时光反应设备，带有质谱（MS）在线监测功能，能同时调整光功率密度和光反应时间。

　　发掘：重氮中间体的重要意义

　　在该项研究中，唐淳研究团队提出了四个模型（I至IV）来描述二氮丙啶的光解动力学过程，以分析二氮丙啶（A）至重氮（B）和卡宾（C）中间体的具体转化途径。通过比较理论曲线和实验数据，最终确定了模型II最适合于解释sulfo-SDA（一种常见烷基二氮丙啶光交联剂）的光解机制。

　　实验揭示，重氮中间体，而非卡宾中间体，在烷基二氮丙啶的光解中起主导作用。反应物和产物的动力学曲线证实了重氮和卡宾中间体依次生成。动力学分析表明，通过细调光照条件，可以增强对极性残基的选择性。这可用于改善蛋白质结构的质谱分析精度。

　　图3: 模型II描述的光解过程中，重氮和卡宾中间体依次生成。

　　应用：偏好极性残基的交联

　　机理分析表明，通过将照射时间和功率密度设定在100 mW/cm²、2 min的理想组合，交联剂可优先与蛋白质中的极性残基反应，包括天冬酰胺（Asp）、谷氨酰胺（Glu）和酪酰胺（Tyr）等。这种优化对确保交联实验的重现性和效率至关重要。交联结果表明，交联位点之间的理论距离与已知的蛋白质结构符合。另外，大多数交联位点处于相对疏水的区域，表明水与它们存在竞争反应。

　　图4: 烷基二氮丙啶对蛋白质残基的偏好随照射时间和功率密度的变化。

　　结论：质谱研究蛋白质结构的一小步

　　该研究为更精确、详细的蛋白质质谱结构分析奠定了基础。该方法具有较大的扩展空间，并有助于蛋白质组学领域的进步。

　　77779193永利集团及生命科学联合中心唐淳教授为该文的通讯作者，77779193永利集团博士研究生江意达为该文的第一作者。该工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金和北京分子科学国家研究中心的资助与支持。

　　团队信息：

　　唐淳教授课题组致力于探索生物大分子的动态世界。创新性地整合多维多核磁共振波谱学、光/化学交联质谱分析，以及人工智能与分子动力学模拟等技术手段，深入研究生物大分子的结构动态及其受环境和化学修饰调控的机制。团队近期还在蛋白质机器亚基互作动态（Cell Res. 2022, 32, 1124）、液液相分离关键作用力（Phys. Rev. Lett. 2023, 130, 118101）、RNA主导相分离体系结构 （JACS 2022, 144, 4716）等方面取得了重要进展。这些研究不仅为理解生物大分子的动态行为提供了新的见解，也为相关疾病的诊断和治疗提供了潜在的靶点。

　　论文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-50315-y

　　排版：高杨

审核：李玲，彭海琳