近日，77779193永利集团、北大-清华生命科学联合中心、北大成都前沿交叉生物技术研究院王初课题组在Journal of the American Chemical Society杂志上发表了题为“Discovery of Cysteine Carboxyalkylations by Real-time Isotopic Signature Targeted Profiling”的文章。在这项工作中，作者开发了名为isoSTAR（isotopic signature targeted profiling）的基于特殊同位素信号的质谱靶向检测新方法，并利用此方法发现了脂肪酸代谢过程中产生的一系列新型半胱氨酸羧甲基化修饰（Cysteine Carboxyalkylations）。

　　图：基于特殊同位素信号开发靶向质谱检测技术，发现脂肪酸代谢中产生的新型半胱氨酸羧甲基化修饰

　　数据依赖性采集（Data-Dependent Acquisition，DDA）是基于质谱的蛋白质组学中最常用的检测方法之一，然而由于质谱扫描速度的限制，其仅会按强度由高到低顺序选择部分肽段离子进行碎裂及二级谱扫描，导致强度较低的肽段离子很难被检测到。王初课题组此前曾开发了基于硒同位素的靶向组学分析方法SESTAR（doi: 10.1021/acscentsci.8b00112）和SESTAR++(doi: 10.1016/bs.mie.2021.10.013)，可以在质谱一级谱数据中选择性识别出可能含硒肽段的同位素信号，从而提升含硒肽段的鉴定效果。然而此方法需要两轮质谱检测才能完成，会造成检测时间及样品的浪费，并且因两次检测间的不平行造成通量减少甚至靶标丢失。在该工作中，作者利用仪器公司提供的质谱控制接口IAPI，在SESTAR基础上开发出了名为isoSTAR的质谱检测流程。isoSTAR利用快速同位素特征识别算法对靶标肽段特殊同位素信号进行实时识别，并立即向质谱发出靶向扫描请求，从而可以一步直接对低丰度靶标肽段进行深度的靶向检测。

　　经过测试，isoSTAR相较于DDA及DDA+SESTAR具有更低的检测限及对靶标肽段更好的检测效果。随后作者结合了isoSTAR与开放式搜索技术开发了代谢过程引发新型翻译后修饰的发现流程。基于代谢过程中有许多翻译后修饰相关的前体及活性中间体，此流程中利用了内源代谢物的生物正交类似物探针进行代谢标记，随后利用带有轻、重甘氨酸1：1混合的脱硫生物素富集标签“GG tag”进行特殊同位素信号的引入及富集，再使用isoSTAR对富集的修饰肽段进行靶向检测。在通过开放式搜索技术分析出肽段信息及PTM的质量偏移后，最终利用一级谱及二级谱上的特征同位素信号筛选出可信的翻译后修饰进入后续验证流程。

　　长链脂肪酸及短链脂肪酸相关的翻译后修饰有较多报导（例如棕榈酰化及巴豆酰化等），而中链脂肪酸相关的翻译后修饰则鲜有报导。作者利用中链脂肪酸类似物辛炔酸对细胞进行了代谢标记，并利用“GG tag”进行特殊同位素信号的引入及富集，再利用isoSTAR进行质谱检测。进行开放式数据搜索后，作者发现了在半胱氨酸上的两种新型PTM，经过验证这些PTM是β-氧化过程中间产物α, β-不饱和脂肪酸与半胱氨酸巯基发生迈克尔加成的产物，作者将此修饰命名为半胱氨酸羧甲基化修饰。在更接近生理环境的条件下，作者也成功发现了脂肪酸β-氧化代谢中间产物对半胱氨酸修饰造成的一系列羧甲基化修饰，证明了新型半胱氨酸羧甲基化修饰在生理或病理环境下的存在。

　　王初教授为该论文的通讯作者，77779193永利集团博士生贾国赓、刘亦成及冯天宇为本文的共同第一作者。张子璇、唐欢、杨帆、高晋君等为此工作的完成做出了重要贡献。该工作得到了科技部重点研发项目、国家自然科学基金、北京分子科学国家研究中心、永利集团AI4S专项等项目的支持。

　　论文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c16183